一、物理滴度

1、病毒顆粒滴度

病毒顆粒滴度又稱為衣殼滴度，是以AAV顆粒數(shù)作為計(jì)量單位，測(cè)定的是AAV顆粒濃度，可分為實(shí)心AAV顆粒滴度、空心AAV顆粒滴度和AAV顆?？偟味鹊取?/span>AAV工藝中較高的空殼率一直是AAV工藝面臨的主要挑戰(zhàn)之一，野生型AAV的空殼率一般在50%以上，AAV工藝采用的基因組序列缺失了部分包裝相關(guān)的順式元件，其空殼率相對(duì)更高。目前監(jiān)測(cè)病毒顆粒滴度或顆粒滴度比值的方法較多，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA）、透射電鏡（Transmissionelectron microscopes, TEM）、高效液相色譜（High-performanceliquid chromatography, HPLC）、分析型超速離心技術(shù)（AnalyticalUltraCentrifugation,AUC）等，其中TEM與AUC一般只用來(lái)檢測(cè)AAV制品中空殼AAV顆粒滴度與實(shí)心AAV顆粒滴度的比值。

（1）ELISA

ELISA通過(guò)與AAV衣殼特異性結(jié)合抗體上連接的酶催化底物反應(yīng)顯色來(lái)測(cè)定AAV顆粒滴度。最常見(jiàn)的為抗體夾心ELISA法，先將捕獲抗體固定在ELISA板上，用于特異性結(jié)合AAV顆粒，然后被捕獲的AAV顆粒通過(guò)和檢測(cè)抗體結(jié)合并加入底物實(shí)現(xiàn)酶促顯色反應(yīng)進(jìn)行定量。目前基于ELISA法的針對(duì)多種血清型抗原表位的特異性單克隆抗體已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。該方法通常用于純化后的AAV，優(yōu)點(diǎn)是重現(xiàn)性和特異性較好，但操作步驟較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期一般較長(zhǎng)。鑒于上述缺點(diǎn)，研發(fā)人員將其轉(zhuǎn)移到成熟的Gyrolab 系統(tǒng)（GyrosProtein Technologies. Gyrolab ImmunoassaySystems?.2020.），開(kāi)發(fā)了一種基于自動(dòng)化微流體平臺(tái)的小型化ELISA，有望縮短實(shí)驗(yàn)周期并將檢測(cè)通量提高到每小時(shí)96個(gè)樣本，同時(shí)將線性范圍提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，無(wú)法區(qū)分完整的實(shí)心AAV顆粒與空殼顆粒是ELISA法的一大遺憾。

（2）TEM

AAV顆粒直徑約為20~26nm，可通過(guò)透射電鏡較為直觀的觀察其外觀，通過(guò)直接計(jì)數(shù)來(lái)定量AAV顆粒，但是用于電子顯微技術(shù)的樣品制備容易產(chǎn)生偽影，一般不用來(lái)計(jì)算絕對(duì)滴度。但在檢測(cè)病毒空殼含量與實(shí)心病毒顆粒含量比值方面，這種方法較為經(jīng)典。相對(duì)包裝了基因組的AAV顆粒，由于未包裝了基因組DNA的病毒顆粒中間密度低，在電鏡下顆粒圖像中部會(huì)出現(xiàn)空洞（黑點(diǎn)），而含基因組病毒顆粒為實(shí)心。但偶爾由于樣本染色操作過(guò)程的差異，可能導(dǎo)致一定誤判，此外，一部分AAV包裝進(jìn)去的基因組不完整，介于空殼顆粒與實(shí)心顆粒之間，也為準(zhǔn)確定量實(shí)心顆粒滴度帶來(lái)一定困難。盡管有報(bào)道TEM可用于未純化的樣品，但它通常被用于純化樣品，因?yàn)榧?xì)胞裂解物中存在的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)會(huì)干擾對(duì)TEM圖像中AAV衣殼的準(zhǔn)確識(shí)別。

（3）HPLC

HPLC是一種快速方便的分析技術(shù)，以液體作為其流動(dòng)相，采用高壓注液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，在化學(xué)產(chǎn)品定量分析中很常見(jiàn)，也可用于定量分析AAV，能夠區(qū)分AAV制品中空衣殼和完整衣殼的含量，且可應(yīng)用于各種血清型AAV定量檢測(cè)，檢測(cè)通量高，可應(yīng)用于AAV工藝中即時(shí)檢測(cè)。尺寸排阻色譜與18角度激光光散射檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)（SEC-MALS）目前已被較為廣泛的應(yīng)用于生物制品的工藝過(guò)程中，是一種功能強(qiáng)大的分析工具。一次進(jìn)樣，15-30min即可精確定量AAV制品的多個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性指標(biāo)：滴度、總蛋白濃度（Cp）、純度/聚集體比例等與傳統(tǒng)方法相比，具有高效、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

（4）AUC

AUC技術(shù)主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門(mén)收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。通過(guò)紫外線吸收或者Raleigh干擾，實(shí)時(shí)掃描檢測(cè)離心過(guò)程中樣本中各個(gè)組分隨著時(shí)間其沉降剖面分布狀態(tài)的變化過(guò)程，計(jì)算出各個(gè)組分的沉降系數(shù)。根據(jù)空殼AAV和實(shí)心AAV沉降系數(shù)差異，可準(zhǔn)確定量空殼AAV滴度和含完整基因組的實(shí)心AAV滴度的比值。

AUC在定量不同顆粒滴度比方面具有重復(fù)性高（變異系數(shù)僅為2%）且能夠有效區(qū)分完整衣殼與空衣殼顆粒。AUC分析法的缺點(diǎn)是只能檢測(cè)純化的AAV制品，且檢測(cè)樣品用量較大。此外AUC檢測(cè)周期較長(zhǎng)，約為6小時(shí)，一次僅能分析3~7個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)通量低。

上述幾種檢測(cè)AAV顆粒滴度或不同顆粒滴度比值的方法，在準(zhǔn)確度、靈敏性及實(shí)驗(yàn)周期等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)，往往需要多種方法互相輔助、相互印證。

2、基因組滴度

基因組滴度以AAV衣殼中所含基因組含量作為定量依據(jù)，測(cè)定的是含目標(biāo)基因組的AAV濃度。AAV中包含的基因組是其表達(dá)蛋白或RNA的前提，是AAV藥物發(fā)揮藥效的核心或基礎(chǔ)，若AAV中不含基因組，藥物不僅沒(méi)有藥效，反而會(huì)增加機(jī)體針對(duì)AAV藥物的免疫反應(yīng)?；蚪M滴度理論上應(yīng)該與生物學(xué)滴度（感染滴度或轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度）呈線性關(guān)系。

基因組滴度測(cè)定目前有PCR法、點(diǎn)雜交法（Dot-blot）和分光光度法等。無(wú)論哪種方法，首先需要將AAV顆粒外部的DNA成分用DNaseI徹底消化去除，否則會(huì)影響定量準(zhǔn)確性，使基因組滴度測(cè)定偏高。

（1）點(diǎn)雜交法

點(diǎn)雜交法是一種較為早期的定量方法，將靶標(biāo)DNA吸附結(jié)合到硝酸纖維膜或尼龍膜上，后采用標(biāo)記的特異性探針與AAV基因組DNA片段雜交結(jié)合，之后通過(guò)熒光或顯色的方式定量AAV基因組滴度。由于雜交溶液中一些成分會(huì)干擾基因組DNA與硝酸纖維膜或尼龍膜結(jié)合等因素，導(dǎo)致其實(shí)驗(yàn)的差異性較高，加之其操作繁瑣，試劑昂貴等因素，逐步被目前其它檢測(cè)方法取代。

（2）PCR法

PCR法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、重復(fù)性好和經(jīng)濟(jì)等因素是目前檢測(cè)AAV基因組滴度最廣泛的方法。PCR法目前常用的包括qPCR法和微滴式數(shù)字PCR法（ddPCR），qPCR作為第二代PCR方法，目前是各個(gè)研究機(jī)構(gòu)及其藥企采用最廣泛的AAV基因組滴度定量方法。而微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）被稱為第三代PCR技術(shù)，作為一種新興技術(shù)與舊的PCR技術(shù)（例如qPCR）相比，可針對(duì)核酸分子做更精確的定量分析。微滴式數(shù)字PCR的創(chuàng)新之處在于標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)微滴發(fā)生，將目標(biāo)分子稀釋到多個(gè)微滴中，每個(gè)微滴大體上只包含一個(gè)或不包含目標(biāo)DNA模板，實(shí)現(xiàn)”單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后含有目標(biāo)分子模板的微滴會(huì)給出熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。因此，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行絕對(duì)定量。

相對(duì)于傳統(tǒng)的qPCR方法，ddPCR在定量準(zhǔn)確性、靈敏度及穩(wěn)定性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。更準(zhǔn)確可靠的病毒載體滴度對(duì)毒理學(xué)及臨床相關(guān)的給藥劑量范圍研究至關(guān)重要。若滴度定量虛高，則實(shí)際藥效可能太低，可能無(wú)療效；若滴度定量虛低，則可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，例如細(xì)胞因子風(fēng)暴。

與qPCR相比，ddPCR不需要依賴多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)來(lái)確定每個(gè)樣品中相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的核酸含量，即ddPCR允許對(duì)樣品中存在的目標(biāo)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)而非相對(duì)標(biāo)曲的“相對(duì)”定量及相對(duì)內(nèi)參的相對(duì)定量。qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性、精確度與實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線直接相關(guān)，目標(biāo)分子定量結(jié)果的準(zhǔn)確性將取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)化情況。在標(biāo)曲樣本與目標(biāo)樣本間擴(kuò)增的差異（例如，標(biāo)曲DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)與待測(cè)目標(biāo)DNA分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能存在明顯差異）可能導(dǎo)致針對(duì)目標(biāo)DNA定量的明顯誤差，因?yàn)椴煌Y(jié)構(gòu)的DNA（環(huán)形、超螺旋、線性；單鏈、雙鏈；不同堿基序列引起的高級(jí)結(jié)構(gòu)等）具有不同的擴(kuò)增效率。因此，使用未優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線將導(dǎo)致絕對(duì)定量結(jié)果不準(zhǔn)確，這可能是不同實(shí)驗(yàn)室間qPCR定量結(jié)果存在顯著差異的重要來(lái)源。有研究表明：qPCR定量對(duì)DNA標(biāo)準(zhǔn)品中二級(jí)結(jié)構(gòu)的抑制作用敏感，這可能導(dǎo)致高估的病毒滴度，而ddPCR定量目標(biāo)分子，其最終定量結(jié)果不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響，如下圖所示。綜上所述，相對(duì)qPCR，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線是ddPCR定量結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性相對(duì)更高的原因之一。

在多數(shù)PCR基礎(chǔ)的反應(yīng)中往往會(huì)存在多種化學(xué)特性的抑制劑，這些成分存在于樣品中，可能與DNA共純化獲得且難以去除。由于ddPCR對(duì)影響PCR擴(kuò)增效率的污染物的敏感性較低，這進(jìn)一步提高了ddPCR準(zhǔn)確性和靈敏度。而qPCR技術(shù)定量原理是需測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品之間Ct值的相對(duì)定量，若需測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中存在抑制物，則PCR效應(yīng)將受影響，可能導(dǎo)致依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的結(jié)果不準(zhǔn)確，若樣品中的PCR抑制物抑制效應(yīng)明顯，則會(huì)明顯降低qPCR靈敏度。

以AAV滴度檢測(cè)為例，AAV滴度檢測(cè)一般要對(duì)基因組進(jìn)行抽提操作，且在定量其滴度前，需要用DNA酶I對(duì)其進(jìn)行消化處理，以降低游離DNA對(duì)AAV定量的影響。另外，若是AAV粗品，則其中會(huì)含有大量的核酸、雜質(zhì)蛋白等生物大分子，因此，無(wú)論是AAV純品還是粗純產(chǎn)品，其樣本PCR反應(yīng)體系中都會(huì)含有相對(duì)多的酶、衣殼蛋白或其它雜質(zhì)蛋白等抑制PCR反應(yīng)的成分，這些成分會(huì)干擾qPCR準(zhǔn)確定量，可能導(dǎo)致qPCR定量的AAV滴度批間或批內(nèi)差異大，不能很好滿足基因治療產(chǎn)品批內(nèi)/批間穩(wěn)定性要求。AAV定量急需一種定量誤差小、準(zhǔn)確且穩(wěn)定性好的方法，據(jù)調(diào)研，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)在這方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，且已受到越來(lái)越多業(yè)內(nèi)人士的青睞。

有研究表明，ddPCR技術(shù)定量下游純化過(guò)程中的AAV樣本，無(wú)論是DNA酶處理組，DNA酶和蛋白酶K處理組，其結(jié)果CV值均小于qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)，說(shuō)明ddPCR檢測(cè)AAV樣本的穩(wěn)定性高于qPCR技術(shù)。

有研究報(bào)道，在qPCR和ddPCR技術(shù)方法的直接比較中，針對(duì)單鏈AAV載體基因組的絕對(duì)定量，dPCR的靈敏度是qPCR的四倍。

（3）分光光度法

二、生物學(xué)滴度

1、感染滴度

測(cè)定AAV感染滴度的目的在于確定其基因組是否轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并進(jìn)行復(fù)制，AAV基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核是其成功表達(dá)基因治療產(chǎn)物的前提，感染滴度與AAV入胞后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率沒(méi)有明顯關(guān)系，因此，不受轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的干擾，有利于含不同基因表達(dá)框的AAV制品間的比較。AAV感染不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞病變效應(yīng)，因此，空斑實(shí)驗(yàn)（plaqueassays）不能用于確定其感染滴度；但是，在輔助病毒存在的情況下，可以誘導(dǎo)AAV基因組的復(fù)制，通過(guò)PCR檢測(cè)或探針雜交法可進(jìn)行感染滴度檢測(cè)。

（1）半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50）

目前廣泛使用的感染滴度測(cè)定方法之一是TCID50法，該方法一般利用腺病毒作為輔助病毒，在輔助病毒存在情況下，AAV經(jīng)10倍倍比稀釋后于96孔板中感染AAV-rep和cap表達(dá)細(xì)胞系，之后通過(guò)PCR檢測(cè)判定陰性與陽(yáng)性孔數(shù)量，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量公式—Spearman-Karber公式來(lái)計(jì)算感染滴度（Alt,Nadja, et al. Biologicals 44.5 (2016): 291-305.）。

目前AAV采用TCID50法面臨的挑戰(zhàn)是精密度差，變異系數(shù)大，多數(shù)文獻(xiàn)發(fā)表的TCID50感染滴度結(jié)果%CV值＞70%，其中輔助病毒的穩(wěn)定性、細(xì)胞類型、細(xì)胞數(shù)量、PCR引物體系、實(shí)驗(yàn)人員的操作等眾多因素都會(huì)影響其定量數(shù)據(jù)，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)參數(shù)控制等要求較高。由于對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作參數(shù)等要求嚴(yán)格，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)AAV基因治療研發(fā)企業(yè)不具備AAVTCID50感染滴度檢測(cè)能力，往往選擇檢測(cè)外包。目前，國(guó)內(nèi)專業(yè)的針對(duì)AAV載體服務(wù)的CRO&CDMO企業(yè)，例如宜明細(xì)胞等具備上述檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，已服務(wù)了多個(gè)成功提交IND申報(bào)或研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)研究用的臨床級(jí)別的AAV產(chǎn)品的批放行檢測(cè)。

（2）ICA法、HSVICA法和RCA法

RCA法（Replicationcenterassay）是較早期的一種檢測(cè)方法，以腺病毒作為輔助病毒，同時(shí)需要野生型AAV（wtAAV）來(lái)提供AAV-rep和cap，AAV感染細(xì)胞24~48h后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到膜上，通過(guò)與與標(biāo)記探針雜交來(lái)檢測(cè)感染中心（代表單個(gè)感染的細(xì)胞），陽(yáng)性信號(hào)表明AAV成功入胞、脫殼，且具有復(fù)制能力，如上所述，該方法無(wú)法檢測(cè)目的基因是否能夠成功表達(dá)。

感染中心檢測(cè)法(infectious center assay，ICA)可以認(rèn)為是RCA法的改進(jìn)版，采用AAV-rep和cap穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為AAV感染細(xì)胞，無(wú)需wtAAV共感染，避免或減少了實(shí)驗(yàn)環(huán)境中wtAAV污染。此外，還可以采用復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒（HSV）來(lái)替代腺病毒和wtAAV提供給RCA法所需的所有輔助元件，無(wú)需輔助性病毒，進(jìn)一步降低了復(fù)制型病毒的污染風(fēng)險(xiǎn)。

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度

轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度是將AAV經(jīng)梯度稀釋后，感染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)目的基因（或轉(zhuǎn)基因）的表達(dá)情況來(lái)判定是否陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量或陽(yáng)性孔數(shù)量，結(jié)合病毒稀釋度來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，其計(jì)量單位為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（Transductionunit,TU)。實(shí)際操作過(guò)程中，提高檢測(cè)靈敏度，往往采用輔助病毒共感染的方式來(lái)提高AAV轉(zhuǎn)基因的表達(dá)率，其計(jì)量單位為增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（Enhancedtransduction unit，ETU）。

目前，轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的測(cè)定一般采用細(xì)胞株體外實(shí)驗(yàn)方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，而非采用AAV基因治療藥物的靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率與細(xì)胞類型有一定的關(guān)系，因此，能采用靶細(xì)胞或與其相近的細(xì)胞類型，檢測(cè)出的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度對(duì)臨床前實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)才具有較好的指導(dǎo)意義。

綜上所述，每種方法也都有各自的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)，每種定量方法僅能檢測(cè)某些理化滴度指標(biāo)或某一生物學(xué)滴度，一種方法無(wú)法檢測(cè)所有滴度指標(biāo)；且都要在檢測(cè)通量和分辨率之間進(jìn)行權(quán)衡取舍。