在了解基因治療之前，首先讓我們來復(fù)習(xí)下什么是基因？什么是基因突變？人體由數(shù)萬億個(gè)細(xì)胞組成。細(xì)胞是所有生物的基本組成部分，每個(gè)細(xì)胞的指揮中心叫做細(xì)胞核，它包含染色體。染色體是由身體的遺傳物質(zhì)DNA構(gòu)成的。而基因就是控制性狀的基本遺傳單位，除某些病毒的基因由RNA構(gòu)成以外，多數(shù)生物的基因由DNA構(gòu)成。簡單點(diǎn)說，基因是有遺傳效應(yīng)的DNA或RNA片段。
既然基因是攜帶遺傳信息的DNA，那就可以通過編碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達(dá)自己所攜帶的遺傳信息，進(jìn)而在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)絕大部分功能。這一作用機(jī)理遵循中心法則：DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA再翻譯為蛋白質(zhì)。
所謂基因突變，不難理解就是基因的DNA序列發(fā)生了變化，如基因替換、插入或缺失等。一旦發(fā)生這樣的突變就可能導(dǎo)致某些必需的蛋白質(zhì)不能產(chǎn)生或者不能正常工作，從而引發(fā)一些疾病。
不少癌變及遺傳性疾病等就是因?yàn)轶w內(nèi)某種基因缺陷或突變引起的，如：
我們所說的基因治療（gene therapy）是指將外源正?；蛲ㄟ^基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞或通過基因編輯技術(shù)對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)基因組進(jìn)行改造，以糾正或代償基因缺陷和異常引起的疾病，最終達(dá)到治療目的的一種生物治療方法。
有了外源正?；?，如何將其引入細(xì)胞呢？直接導(dǎo)入肯定不切實(shí)際，因?yàn)橛坞x的DNA進(jìn)入細(xì)胞后一般會(huì)直接被分解。就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，翻譯成蛋白，游離的DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，就會(huì)導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。換句話說，你費(fèi)力將基因?qū)胧荏w細(xì)胞,結(jié)果只有一個(gè)細(xì)胞被改變了，整個(gè)群體細(xì)胞不會(huì)有任何變化。這時(shí)候就需要一種叫做“載體”的工具來幫助穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)，將基因傳遞到細(xì)胞中。下面我們就一起來了解下都有哪些載體可以用于基因治療。基因治療載體有兩個(gè)重要功能——一個(gè)是保護(hù)殼內(nèi)的脆弱“貨物”，第二個(gè)是其表面配體與特定細(xì)胞相互作用。其種類很多，可分為病毒載體和非病毒載體。
2）外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞后表達(dá)時(shí)間短；3）非特異性靶向較高等原因，在人體靶向基因治療中使用較少。所以基因治療常用病毒載體作為遞送系統(tǒng)，最常見的病毒載體包括腺病毒（AdV）、腺相關(guān)病毒（AAV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）和慢病毒（LV）。其中慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒由于其可以將外源基因隨機(jī)插入并整合到宿主細(xì)胞基因組中，存在因?yàn)殡S機(jī)插入造成基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，考慮到安全性問題，適用性并不那么廣泛。腺病毒（AdV）是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，腺病毒載體宿主細(xì)胞范圍廣泛，可有效感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，不與宿主細(xì)胞基因組整合，因而不存在插入突變風(fēng)險(xiǎn)，載體容量較大。但其也存在一些不足之處：①缺乏特異靶向性，在一些缺乏其相應(yīng)受體的細(xì)胞中感染效率低；②目的基因的表達(dá)時(shí)間短，可能需要重復(fù)治療；③有較強(qiáng)的免疫原性，容易產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)帶來一定風(fēng)險(xiǎn)。腺相關(guān)病毒（AAV）是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA病毒。其相較于腺病毒免疫源性低，另外由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因治療載體，在世界范圍內(nèi)的基因治療研究中應(yīng)用最為廣泛。
下面我們就一起來詳細(xì)了解AAV是如何一步步成為基因治療中的明星載體。腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）屬于細(xì)小病毒科，Dependoparvovirus屬，病毒表面由衣殼蛋白VP1，VP2，VP3總共60拷貝，按1：1：10比例組成的二十面體結(jié)構(gòu)，無包膜，直徑約26nm。衣殼蛋白的不同突變型產(chǎn)生了不同的AAV亞型，按血清試驗(yàn)結(jié)果可以分為不同血清型，目前已有超過10種AAV血清型（AAV1～AAV10）。其基因組為線性單鏈DNA，大小約4.7kb?；蚪M的兩端是兩個(gè)T形反向末端重復(fù)序列(ITR)，主要用作病毒復(fù)制起點(diǎn)和包裝信號(hào)。中間編碼區(qū)有2個(gè)開放閱讀框，其中Rep基因編碼病毒復(fù)制所需的四種蛋白質(zhì)：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40（以其分子量命名）。Cap基因通過來自不同起始密碼子的可變剪接和翻譯編碼三個(gè)衣殼亞基。
以上所說的是野生型 AAV，其是一種復(fù)制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或皰疹病毒幫助其在體內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增。而基因治療中所用的是不需要輔助病毒的重組腺相關(guān)病毒（Recombinant AAV， rAAV），其是在設(shè)計(jì)AAV載體基因組時(shí)，將編碼區(qū)基因序列替換為目的基因和相關(guān)功能片段，僅保留兩端反向末端重復(fù)序列，在質(zhì)粒中表達(dá)包裝病毒，然后直接使用 rAAV 感染細(xì)胞。病毒編碼序列的完全去除一方面可以最大化重組 AAV 攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面可減小在體內(nèi)遞送時(shí)的免疫原性和細(xì)胞毒性。這也就是我們所說的AAV載體。
rAAV生產(chǎn)-三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法
rAAV在生產(chǎn)時(shí)多采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法。具體制備流程為，首先構(gòu)建并純化獲得三個(gè)質(zhì)粒：1）順式載體質(zhì)粒編碼AAV反向末端重復(fù)序列和目的基因；
2）反式質(zhì)粒編碼AAV的rep和cap基因；3）輔助質(zhì)粒通常編碼腺病毒的輔助基因。然后將三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞株，就能在細(xì)胞裂解液中得到攜帶目的基因的rAAV。這種制備方法需要制備大量高質(zhì)量的載體質(zhì)粒，rAAV的產(chǎn)量在很大程度上取決于轉(zhuǎn)染的效率。
綜合以上，用一句話簡單的概括：rAAV與AAV的區(qū)別在于內(nèi)部基因不同，外殼相同。由于AAV根據(jù)不同的衣殼蛋白有不同的血清型，所以rAAV作為基因治療的遞送載體也有不同血清型。目前文獻(xiàn)中使用最多的 rAAV 血清型包括 2、5、8、9。這幾種血清型基本涵蓋了大部分組織和臟器的特異性感染。得到rAAV之后，它又是怎么進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用的？rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞主要有識(shí)別細(xì)胞表面受體、內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼、雙鏈轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和翻譯幾個(gè)過程。如下圖所示，具體每一步為：1） rAAV被靶細(xì)胞表面糖基化修飾的受體識(shí)別；
2） 通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，包裹于早期內(nèi)體中；3）rAAV在細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)的幫助下由細(xì)胞胞漿向細(xì)胞核運(yùn)輸；4）在內(nèi)體的酸性環(huán)境下，rAAV的衣殼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出VP1和VP2的N末端，rAAV病毒粒子從晚期內(nèi)體中釋放出來；5）逃離內(nèi)體后的rAAV或者由蛋白酶體進(jìn)行蛋白降解，或者進(jìn)入細(xì)胞核；6）rAAV病毒粒子一旦進(jìn)入細(xì)胞核，就會(huì)脫殼并釋放其單鏈基因組，并復(fù)制形成雙鏈DNA (dsDNA)模板；7）在雙鏈DNA模板上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯為治療性蛋白質(zhì)。相信介紹到這，對(duì)于開頭的問題大家都有了答案。最后讓我們?cè)僖黄饋砜偨Y(jié)一下rAAV作為基因治療載體的優(yōu)勢(shì)有哪些。安全性高：目前還沒有發(fā)現(xiàn) AAV 對(duì)人體致??；每 10 個(gè)人中就有 8 個(gè)人在一生中會(huì)感染 AAV，而 rAAV 更是去除了 96% 的 AAV 基因組，進(jìn)一步確保了安全性。
免疫原性低：當(dāng)用AAV 局部大劑量感染肌肉、腦、眼等組織時(shí)，很少有感染上的細(xì)胞之后被免疫系統(tǒng)所清除。這種特性對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上顯然極有幫助。
宿主范圍廣：幾乎所有處于分裂期和靜止期的細(xì)胞都可以使用 AAV 來感染。
表達(dá)時(shí)間長：rAAV 可在宿主細(xì)胞中形成附加體（episome）存在于細(xì)胞核中，在細(xì)胞分裂不旺盛的組織中可持續(xù)表達(dá) 5 個(gè)月以上。
擴(kuò)散性強(qiáng)：rAAV 具有遠(yuǎn)高于腺病毒和慢病毒的擴(kuò)散性，可以穿透血腦屏障，是最理想的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞感染工具。
特異性強(qiáng)：rAAV 有數(shù)十種常用的血清型，不同的血清型對(duì)不同的臟器有較高的識(shí)別及感染能力。
近年來基因治療研究越來越火熱，已經(jīng)成為全球最具發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)藥領(lǐng)域之一。作為一種革命性的治療手段，具有“一次注射，終生治愈”的潛力，給諸多難治性疾病患者帶來了曙光。另外隨著AAV遞送系統(tǒng)不斷成熟，基因治療已逐步走向快速發(fā)展的黃金賽道。
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